CRISPR/Cas9（規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)序列及相關(guān)蛋白9）核酸酶表達(dá)載體屬于幾種新興的基因組編輯工具之一（另外兩種是ZFN和TALEN），可在基因組的靶位點(diǎn)快速有效地產(chǎn)生突變。這些質(zhì)粒載體編碼的特異性RNA，能夠引導(dǎo)DNA核酸酶（或缺刻酶）編輯基因組中特定位點(diǎn)的DNA序列。

Cas9是RNA引導(dǎo)DNA核酸酶，是天然原核免疫系統(tǒng)的一部分，賦予細(xì)菌產(chǎn)生對(duì)質(zhì)粒和噬菌體等外源遺傳物質(zhì)的抵抗能力。在細(xì)胞內(nèi)，Cas9核酸酶與引導(dǎo)RNA（gRNA）形成復(fù)合物，該復(fù)合物通過(guò)與基因組中的18-22 nt的同源靶序列直接相互作用，gRNA與靶位點(diǎn)通過(guò)互補(bǔ)配對(duì)使Cas9定位到靶序列上，然后切割基因組中的靶位點(diǎn)。為了方便使用，我們?cè)O(shè)計(jì)的CRISPR/Cas9載體能夠在一個(gè)載體上同時(shí)有效表達(dá)Cas9核酸酶（或缺刻酶）和引導(dǎo)RNA（gRNA）。

使用CRISPR打靶目的基因需要目標(biāo)細(xì)胞同時(shí)表達(dá)Cas9和特異gRNA。這可以通過(guò)在同一個(gè)載體上共表達(dá)Cas9和gRNA，也可以通過(guò)在兩個(gè)載體各上自表達(dá)Cas9和gRNA來(lái)實(shí)現(xiàn)。使用Cas9和gRNA兩個(gè)載體分開(kāi)表達(dá)的優(yōu)勢(shì)在于可使用不同的gRNA與不同的Cas9變體組合（如Cas9n，dCas9），從而帶來(lái)更多變的實(shí)驗(yàn)方案。

我們的AAV SagRNA表達(dá)載體是專門(mén)搭配SaCas9使用的。SaCas9來(lái)源于Staphylococcus aureus，其序列比來(lái)源于Streptococcus pyogenes的SpCas9要短1 kb以上。因此較小長(zhǎng)度的SaCas9序列更適合小裝載量的AAV病毒的包裝生產(chǎn)。SaCas9與SpCas9有兩個(gè)方面的差異：第一，SaCas9要求搭配的gRNA的骨架序列與SpCas9要求的不同。與SaCas9適配的gRNA叫SagRNA；第二，SaCas9識(shí)別的PAM序列是NNGRR（優(yōu)先NNGRRT），而SpCas9識(shí)別的PAM序列為NGG（較多情況）和NAG（少數(shù)情況）。

我們的AAV SagRNA表達(dá)載體既可以表達(dá)單SagRNA也可以表達(dá)雙SagRNA。單SagRNA被常用于傳統(tǒng)的基因編輯如基因敲除，而雙SagRNA適用于需要用2個(gè)gRNA同時(shí)打靶基因組兩個(gè)區(qū)域的情況，如造成兩個(gè)DSB之間的片段刪除，同時(shí)打靶兩個(gè)不同的基因等當(dāng)一個(gè)SagRNA載體上含有單個(gè)人U6啟動(dòng)子時(shí)可以驅(qū)動(dòng)兩個(gè)ITR區(qū)域之間的單SagRNA表達(dá)。雙SagRNA載體則含有兩個(gè)U6啟動(dòng)子用以驅(qū)動(dòng)兩個(gè)特異于打靶序列的SagRNA表達(dá)。

AAV SagRNA表達(dá)載體首先在構(gòu)建可在E. coli中復(fù)制的質(zhì)粒DNA，然后與輔助質(zhì)粒一并轉(zhuǎn)染至包裝細(xì)胞。位于載體上的兩個(gè)ITR區(qū)域之間的序列將被包裝至有活性的病毒顆粒當(dāng)中。病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)，兩個(gè)ITR區(qū)域之間的SagRNA表達(dá)盒連同病毒基因組的其他組分都會(huì)進(jìn)入靶細(xì)胞。表達(dá)盒中的人源U6啟動(dòng)子將驅(qū)動(dòng)SagRNA序列轉(zhuǎn)錄。SagRNA隨后引導(dǎo)SaCas9打靶目的序列。

野生型AAV基因組（ssAAV）是一條線性單鏈DNA分子（ssDNA），并含有兩個(gè)ITR區(qū)域在基因組的兩端形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。ssAAV在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)時(shí)，其基因組首先需要被轉(zhuǎn)化成雙鏈DNA（dsDNA），這個(gè)過(guò)程有兩個(gè)途徑：1. 使用宿主細(xì)胞的DNA聚合酶和ssAAV基因組上的3’ ITR序列作為引物結(jié)合點(diǎn)合成第二鏈DNA；2. ssAAV基因組的正義鏈和負(fù)義鏈之間形成分子內(nèi)的dsDNA結(jié)構(gòu)。兩種途徑中前者是形成dsDNA的主要方式。

AAV線性雙鏈DNA基因組在細(xì)胞核內(nèi)會(huì)形成游離形式的多聯(lián)體。在非分裂細(xì)胞中，這些多連體會(huì)長(zhǎng)久存在直到宿主細(xì)胞死亡。而在分裂細(xì)胞中，游離的DNA多聯(lián)體會(huì)因?yàn)榧?xì)胞分裂而被稀釋，這是因?yàn)橛坞xDNA不能隨著宿主基因組復(fù)制而復(fù)制。AAV基因組隨機(jī)整合宿主基因組的概率是很小的。AAV的這種特性對(duì)于應(yīng)用于基因治療是可貴的，因?yàn)檩d體上的外源DNA整合宿主基因組的情況是有潛在的致癌性質(zhì)的。

AAV的一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是，在大多數(shù)情況下，可以在生物安全1級(jí)（BSL1）設(shè)施中操作。AAV是復(fù)制缺陷型的、不會(huì)引起炎癥反應(yīng)和引發(fā)人類疾病。有賴于AAV對(duì)宿主的低免疫原性，我們的ssAAV gRNA表達(dá)載體是體內(nèi)CRISPR應(yīng)用的完美工具。

人們已從自然界中鑒定出許多AAV病毒株，根據(jù)病毒表面衣殼蛋白的不同抗原將它們分成不同的血清型。不同血清型的病毒具有不同的組織親和性（即感染組織特異性）。當(dāng)我們的AAV載體使用不同的衣殼蛋白包裝病毒時(shí)，則會(huì)賦予病毒不同的血清型。AAV包裝時(shí)的ITR序列來(lái)源于AAV2，這是一種常用的AAV載體構(gòu)建方式，不影響血清型。另一方面，決定血清型的衣殼蛋白基因由Rep/Cap包裝質(zhì)粒編碼。下表列出了不同的AAV血清型及對(duì)應(yīng)的組織嗜性。

關(guān)于該載體系統(tǒng)的更多信息，請(qǐng)參考以下文獻(xiàn)。

我們的AAV載體是經(jīng)過(guò)優(yōu)化的，可在大腸桿菌中進(jìn)行高拷貝復(fù)制，是一個(gè)包裝病毒滴度高，細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高，轉(zhuǎn)基因高水平表達(dá)的載體系統(tǒng)。該載體可用所有載體家提供的衣殼蛋白血清型的輔助質(zhì)粒進(jìn)行包裝，包裝出來(lái)的病毒具有非常高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，且具有極高的生物安全性。

適用于基于SaCas9的CRISPR實(shí)驗(yàn)應(yīng)用：我們的SagRNA表達(dá)載體是專門(mén)為搭配來(lái)源于Staphylococcus aureus的SaCas9使用的。SaCas9序列比來(lái)源于Streptococcus pyogenes的SpCas9要短1kb以上，因此更適合小裝載量的AAV病毒包裝。

安全性：AAV是可供選擇的最安全的病毒載體，它是復(fù)制缺陷的，不會(huì)引起任何人類疾病。

對(duì)宿主基因組造成破壞的低風(fēng)險(xiǎn)性：在轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入靶細(xì)胞后，AAV病毒載體在細(xì)胞核保持著游離DNA的狀態(tài)，可以降低宿主基因組被破壞而致癌的風(fēng)險(xiǎn)，使其成為人類體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的理想載體。

高病毒滴度：利用我們的AAV病毒載體可以包裝成高滴度的病毒。我們提供的病毒包裝服務(wù)病毒滴度可達(dá)到>10¹³ GC/ml。

宿主范圍廣：針對(duì)不同來(lái)源的常用哺乳動(dòng)物（如人、小鼠和大鼠）細(xì)胞和組織，將我們的AAV載體包裝成對(duì)其具有親和性的血清型，可輕易實(shí)現(xiàn)高效轉(zhuǎn)導(dǎo)。但是，某些類型的細(xì)胞仍然難以轉(zhuǎn)導(dǎo)（見(jiàn)下文不足之處），這與所用的血清型有關(guān)。

體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均有效：我們的載體不僅能用于體內(nèi)活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，還具有體外細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)能力。

難以轉(zhuǎn)導(dǎo)特定類型的細(xì)胞：當(dāng)利用合適的血清型進(jìn)行包裝時(shí)，我們的AAV載體系統(tǒng)可以轉(zhuǎn)導(dǎo)很多不同類型的細(xì)胞，包括非分裂細(xì)胞。不同AAV血清型對(duì)不同類型的細(xì)胞具有不同的嗜性，針對(duì)某種特定類型的細(xì)胞需要特定血清型。

技術(shù)復(fù)雜：使用AAV病毒載體時(shí)，需要在包裝細(xì)胞中產(chǎn)生活病毒，然后測(cè)定病毒滴度。這些過(guò)程相對(duì)于常規(guī)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，技術(shù)難度更高，周期更長(zhǎng)。在訂購(gòu)載體的同時(shí)，可以通過(guò)訂購(gòu)我們的病毒包裝服務(wù)輕松解決這些問(wèn)題。

PAM序列依賴：我們的AAV SagRNA表達(dá)載體是搭配來(lái)源于Staphylococcus aureus的SaCas9使用的。SaCas9介導(dǎo)的CRISPR打靶依賴于位于gRNA識(shí)別序列3’末端的PAM序列NNGRR（優(yōu)先NNGRRT）。

Single-SagRNA expression AAV vector

5' ITR: 5' inverted terminal repeat. In wild type virus, 5' ITR and 3' ITR are essentially identical in sequence. They reside on two ends of the viral genome pointing in opposite directions, where they serve as the origin of viral genome replication.

U6 Promoter: Drives expression of the downstream SagRNA sequence. This is the promoter of the human U6 snRNA gene, an RNA polymerase III promoter which efficiently expresses short RNAs.

SagRNA: Guide RNA compatible with Cas9 derived from Staphylococcus aureus.

Terminator: Terminates transcription of the SagRNA.

CMV promoter: Human cytomegalovirus immediate early enhancer/promoter. It drives the ubiquitous expression of the downstream marker gene.

Marker: A drug selection gene (such as neomycin resistance), a visually detectable gene (such as EGFP), or a dual-reporter gene (such as EGFP/Neo). This allows cells transduced with the vector to be selected and/or visualized.

SV40 late pA: Simian virus 40 late polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

3' ITR: 3' inverted terminal repeat. See description for 5’ ITR.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.